BAB I
PENDAHULUAN
1.1
Latar
Belakang
Pembahasan
tentang pewarisan sifat pada eukariot selalu dikaitkan dengan gen-gen yang
terletak di dalam kromosom/nukleus. Kenyataannya gen-gen kromosomal ini memang
memegang peranan utama di dalam pewarisan sebagian besar sifat genetik.
Meskipun demikian, sesekali pernah pula dilaporkan bahwa ada sejumlah sifat
genetik yang pewarisannya diatur oleh unsur-unsur di luar nukleus. Pewarisan
ekstranukleus, atau dikenal pula sebagai pewarisan sitoplasmik, ini tidak
mengikuti pola Mendel. Pewarisan sifat sitoplasmik diatur oleh materi genetik
yang terdapat di dalam organel-organel seperti mitokondria, kloroplas (pada
tumbuhan), dan beberapa komponen sitoplasmik lainnya. Begitu juga virus dan
partikel mirip bakteri dapat bertindak sebagai pembawa sifat herediter
sitoplasmik.
Dalam
pewarisan sifat ada beberapa tipe muatan petit. Selain di dalam kromosom materi
genetik juga terjadi diluar kromosom. Dalam rekomendasi DNA perlu beberapa
komponen yang diperlukan dan juga dalam proses kloning DNA.
1.2 Rumusan
Masalah
Dari latar belakang diatas, maka dapat dirumuskan
masalah sebagai berikut:
1.
Apa
saja kriteria pewarisan sitoplasmik?
2.
Apa
saja tipe-tipe muatan petit?
3.
Bagaimana
materi genetik diluar kromosom?
4.
Apa
maksud dari rekomendasi DNA, dan komponen-komponen yang diperlukan dam
pembentukan rekomendasi DNA?
5.
Penjelasan
tentang kloning DNA?
1.3 Tujuan Penulisan
Dari rumusan masalah diatas, maka
tujuan dari pembuatan makalah ini yaitu:
1. Mengetahui kriteria pewarisan
sifat sitoplasmik.
2. Mengetahui tipe-tipe muatan
petit.
3. Mengetahui materi genetik diluar
kromosom.
4. Mengetahui apa itu rekombinasi DNA.
5. Mengetahui juga tentang kloning DNA.
1.4 Metode
Penulisan
Metode dalam makalah ini yaitu
metode deskriptif yang teknik studi kepustakaan atau literaturenya yaitu
pengetahuan yang bersumber dari beberapa media tulis baik berupa buku,
literature, dan media elektronik (internet) yang tentu ada kaitannya
masalah-masalah yang dibahas di dalam makalah ini.
BAB II
PEMBAHASAN
PEMBAHASAN
Pewarisan sitoplasmik adalah pewarisan sifat yang disebabkan
oleh bagian eksternal dari nukleus, yaitu dengan adanya protein Histon yang
dipilin oleh DNA di dalam kromosom yang berada di daerah sitoplasma.
Pewarisan
sitoplasmik dapat juga merupakan pewarisan sifat di mana sifat-sifat tersebut
tidak diatur oleh materi genetik di dalam kromosom melainkan di dalam
sitoplasma.
2.1 Kriteria Pewarisan Sitoplasmik
Lima hal yang dapat membedakan
pewarisan sitoplasmik dengan pewarisan gen-gen kromosomal, yaitu:
a.
Perbedaan hasil perkawinan resiprok merupakan
penyimpangan dari pola Mendel.
b.
Sel kelamin betina biasanya membawa sitoplasma dan
organel sitoplasmik dalam jumlah lebih besar daripada sel kelamin jantan.
Organel dan simbion di dalam sitoplasma dimungkinkan untuk diisolasi dan
dianalisis untuk mendukung pembuktian tentang adanya transmisi maternal dalam
pewarisan sifat. Jika materi sitoplasmik terbukti berkaitan dengan pewarisan
sifat tertentu, maka dapat dipastikan bahwa pewarisan sifat tersebut merupakan
pewarisan sitoplasmik.
c.
Gen-gen kromosomal menempati loki tertentu dengan
jarak satu sama lain yang tertentu pula sehingga dapat membentuk kelompok
berangkai.
d.
Tidak adanya nisbah segregasi Mendel menunjukkan bahwa
pewarisan sifat tidak diatur oleh gen-gen kromosomal tetapi oleh materi
sitoplasmik.
e.
Substitusi nukleus dapat memperjelas pengaruh relatif
nukleus dan sitoplasma. Jika pewarisan suatu sifat berlangsung tanpa adanya
pewarisan gen-gen kromosomal, maka pewarisan tersebut terjadi karena pengaruh
materi sitoplasmik.
Substitusi
nukleus dapat memperjelas pengaruh relatif nukleus dan sitoplasma. Jika
pewarisan suatu sifat berlangsung tanpa adanya pewarisan gen-gen kromosomal,
maka pewarisan tersebut terjadi karena pengaruh materi sitoplasmik.
2.2 Organel Sitoplasmik Pembawa Materi Genetik
Di dalam
sitoplasma antara lain terdapat organel-organel seperti mitokondria dan
kloroplas, yang memiliki molekul DNA dan dapat melakukan replikasi subseluler
sendiri. Oleh karena itu, kedua organel ini disebut organel otonom.
Mitokondria,
yang dijumpai pada semua jenis organisme eukariot, membawa hingga lebih kurang
50 gen di dalam molekul DNAnya. Gen-gen ini di antaranya bertanggung jawab atas
struktur mitokondria dan pengaturan berbagai bentuk metabolisme energi. Enzim-enzim
untuk keperluan respirasi sel dan produksi energi terdapat di dalam
mitokondria. Begitu juga bahan makanan akan dioksidasi di dalam organel ini
untuk menghasilkan senyawa adenosin trifosfat (ATP), yang merupakan bahan bakar
bagi berbagai reaksi biokomia.
Sementara
itu, kloroflas sebagai organel fotosintetik pada tumbuhan dan beberapa
mikroorganisme membawa sejumlah materi genetik yang diperlukan bagi struktur
dan fungsinya dalam melaksanakan proses fotosintesis. Klorofil beserta
kelengkapan untuk sintesisnya telah dirakit ketika kloroplas masih dalam bentuk
alga yang hidup bebas.
Beberapa
tipe muatan petit :
a.
Petit segregasional
Petit segregasional memperlihatkan segregasi Mendel seperti biasanya sehingga dinamakan petit
segregasional. Persilangan dengan tipe liarnya menghasilkan zigot diploid yang
normal. Jika zigot ini mengalami pembelahan meiosis, akan diperoleh empat
askopora haploid dengan nisbah fenotipe 2 normal : 2 petit. Hal ini menunjukkan petit segregasional ditimbulkan oleh mutasi di dalam
nukleus. Selain itu, oleh karena zigot diploid mempunyai fenotipe normal, maka
dipastikan bahwa alel yang mengatur mutan petit merupakan alel resesif.
b.
Petit netral
Petit netral, berbeda dengan tipe segregasional jika dilihat dari keempat askopora
hasil pembelahan meiosis zigot diploid. Keempat askospora ini semuanya normal.
Hasil yang sama akan diperoleh apabila zigot diploid disilang balik dengan
tetua petitnya. Jadi, fenotipe keturunan hanya ditentukan oleh tetua normalnya. Dengan perkataan lain, pewarisan sifatnya merupakan pewarisan uniparental. Yaitu disebabkan oleh hilangnya sebagian besar atau seluruh materi genetik di
dalam mitokondria yang menyandi sintesis enzim respirasi oksidatif pada
kebanyakan petit netral. Ketika sel petit netral bertemu dengan sel tipe liar,
sitoplasma sel tipe liar akan menjadi sumber materi genetik mitokhodria bagi
spora-spora hasil persilangan petit dengan tipe liar sehingga semuanya akan
mempunyai fenotipe normal.
c.
Petit supresif
Petit supresif, yang hingga kini belum dapat dijelaskan dengan baik. Pada persilangannya
dengan tipe liar dihasilkan zigot diploid dengan fenotipe petit. Selanjutnya,
hasil meiosis zigot petit ini adalah empat askospora yang semuanya mempunyai
fenotipe petit. Dengan demikian, seperti halnya pada tipe petit netral,
pewarisan uniparental juga terjadi pada tipe petit supresif. Bedanya, pada
petit supresif alel penyebab petit bertindak sebagai penghambat (supresor)
dominan terhadap aktivitas mitokondria tipe liar. Petit supresif juga mengalami
kerusakan pada materi genetik mitokondrianya tetapi kerusakannya tidak separah
pada petit netral.
2.3 Materi Genetik Diluar Kromosom
Pada
beberapa hal gen nonkromosom dapat berbentuk benda asing seperti sigma dan
kappa, sedangkan pada hal lain dapat berupa bagian dari sitoplasma, misalnya
plastid. Keduanya terdapat di luar inti sel, yaitu pada sitoplasma, dan
tersusun dari bahan DNA, yang dapat berduplikasi dan mutasi. Pewarisan melalui
sitoplasma ini mempunyai beberapa pola, antara lain adanya pengaruh maternal. Pada
pola ini fenotip turunan ditentukan tidak oleh genotipnya sendiri, melainkan
oleh genotip yang dimiliki induk betina, melalui sel telur. Pola yang lain
ialah bahwa sifat genetika diturunkan/diwariskan tidak oleh gen kromosom,
tetapi oleh gen nonkromosom yang telah dipengaruhi oleh gen kromosom.
2.3.1
Plasmid
1
Sifat plasmid
Plasmid
adalah molekul DNA berbentuk sirkuler yang terdapat di dalam sel bakteri atau
ragi. Plasmid merupakan DNA nonkromosom, karena sel tersebut memiliki kromosom
tersendiri. Jadi selain kromosom, di dalam sel bakteri terdapat pula plasmid.
Plasmid adalah elemen genetik yang bereplikasi secara bebas dari kromosom
hospes. Hampir semua plasmid yang sudah dikenal adalah DNA pita ganda (double
stranded DNA). Sebagian besar plasmid sirkular (melingkar). Secara alamiah,
plasmid mempunyai berbagai ukuran mulai dari 1-1000 kilo bp. Plasmid khusus
adalah suatu molekul DNA double stranded sirkular yang berukuran kurang dari
1/20 ukuran kromosom. Sebagian besar DNA plasmid diisolasi dari sel dalam
konfigurasi supercoil yang berbentuk padat dalam sel. Putusnya satu dari dua
pita menyebabkan supercoil berubah menjadi bentuk sirkular terbuka, selanjutnya
terjadi putusnya kedua pita pada tempat yang sama. Sehingga terbentuk suatu
struktur rangkap linier.
Sifat-sifat plasmid
antara lain :
a.
Merupakan molekul DNA yang mengandung gen tertentu,
ukuranya kira kira 1/1000 kali kromosom (DNA) bakteri.
b.
Dapat memperbanyak diri melalui proses replikasi.
Dengan demikian terjadi pengklonaan DNA yang menghasilkan plasmid dalam jumlah
banyak. Satu sel dapat berisi banyak plasmid.
c.
Plasmid dapat berpindah ke sel bakteri lain.
Perpindahan plasmid dapat dipercepat dengan member ion CsCl (sesium klorida).
Dengan demikian plasmid dapat dikeluarkan dan dimasukan ke dalam sel bakteri
atau ragi.
d.
Sifat bakteri pada keturunan sama dengan induknya,
karena plasmid terikat dengan kromosaom inti.
2
Jenis-jenis
Plasmid
Salah satu
cara pengelompokan plasmid adalah dengan kemampuan mereka untuk ditransfer ke
bakteri lain. Konjugasi plasmid
mengandung apa yang disebut tra-gen, yang melakukan proses kompleks konjugasi,
transfer plasmid ke bakteri lain.
Non-konjugasi
plasmid tidak mampu memulai konjugasi, maka mereka hanya dapat dipindahkan
dengan bantuan konjugatif plasmid.
Cara lain
untuk mengklasifikasikan plasmid yaitu menurut fungsinya. Ada lima kelas utama:
Þ
Kesuburan-F-plasmid, yang berisi tra-gen. Mereka mampu
konjugasi (transfer materi genetik antara bakteri yang menyentuh).
Þ
Perlawanan-(R) plasmid, yang mengandung gen yang dapat
membangun perlawanan terhadap antibiotik atau racun dan membantu menghasilkan
pili bakteri. Sejarah dikenal sebagai R-faktor, sebelum sifat plasmid dipahami.
Þ
Col-plasmid, yang mengandung gen yang kode untuk
(menentukan produksi) bacteriocins, protein yang dapat membunuh bakteri lain.
Þ
Degradatif plasmid, yang memungkinkan pencernaan
zat-zat yang tidak biasa, misalnya, toluene atau asam salisilat.
Þ
Plasmid virulensi, yang mengubah bakteri menjadi
patogen (yang menyebabkan penyakit).
Plasmid
dapat dikelompokkan pada lebih dari satu kelompok fungsional:
Ø Berdasarkan
jumlah kopi yang dimiliki plasmid:
a)
Low copy-number → 1-2 kopi/sel.
b)
High copy-number → lebih dari 500 kopi/sel.
Ø Berdasarkan
penghambatan replikasi:
a)
Relaxed plasmid → replikasi DNA plasmid tidak dihambat
walaupun replikasi DNA kromosom sel inang dihambat.
b)
Stringent plasmid → jika replikasi DNA sel inang
dihambat maka replikasi pada plasmidnya juga akan dihambat.
Ø Berdasarkan
bentuknya:
a)
Covalently closed circles (DNA ccc), bentuk sirkuler
untai ganda utuh.
b)
Open circles (DNA oc), DNA sirkuler untai ganda dengan
satu rantai yang utuh, disukai karena mudah untuk diamplifikasi serta mudah
diisolasi dan manipulasi.
2.3.2
Vektor
Ada dua
jenis integrasi plasmid ke dalam bakteri inang: Non-integrasi plasmid meniru
seperti contoh pada gambar, sedangkan episomes, contoh yang lebih rendah,
mengintegrasikan ke dalam host kromosom.
Plasmid yang
digunakan dalam rekayasa genetika disebut vektor. Plasmid berfungsi sebagai
alat penting dalam genetika dan bioteknologi laboratorium, di mana mereka
biasanya digunakan untuk mengalikan (membuat banyak salinan) atau mengekspresikan
gen tertentu. Banyak plasmid tersedia secara komersial untuk penggunaan semacam
itu.
Gen dapat
direplikasi dimasukkan ke dalam salinan plasmid yang mengandung gen yang
membuat sel-sel resisten terhadap antibiotik tertentu dan beberapa situs
kloning (MCS, atau polylinker), yang merupakan daerah pendek yang biasa
digunakan mengandung beberapa pembatasan situs-situs yang mudah memungkinkan
penyisipan DNA fragmen di lokasi ini. Selanjutnya, dimasukkan ke dalam plasmid
bakteri oleh suatu proses yang disebut transformasi. Kemudian, bakteri yang
terkena antibiotik tertentu. Hanya bakteri yang mengambil salinan plasmid
bertahan hidup, karena plasmid membuat mereka tahan. Secara khusus, melindungi
gen dinyatakan (digunakan untuk membuat protein) dan protein yang dinyatakan
rusak antibiotik. Dengan cara ini antibiotik yang bertindak sebagai filter
untuk memilih hanya yang diubah bakteri. Sekarang bakteri ini dapat tumbuh dalam
jumlah besar, dipanen dan lysed (sering menggunakan lisis alkali metode) untuk
mengisolasi plasmid bunga.
Agar dapat
digunakan sebagai vektor kloning, plasmid harus memenuhi syarat-syarat berikut
ini:
1.
Mempunyai ukuran relatif kecil bila dibandingkan dengan
pori dinding sel inang sehingga dapat dengan mudah melintasinya.
2.
Mempunyai sekurang-kurangnya dua gen marker yang dapat
menandai masuk tidaknya plasmid ke dalam sel inang.
3.
Mempunyai tempat pengenalan restriksi
sekurang-kurangnya di dalam salah satu marker yang dapat digunakan sebagai
tempat penyisipan fragmen DNA.
4.
Mempunyai titik awal replikasi original sehingga dapat
melakukan replikasi di dalam sel inang.
2.3.3
Isolasi DNA
Plasmid
DNA plasmid merupakan wadah yang
digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA
kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA
kromosom.
Untuk memisahkan DNA plasmid, maka
memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas. Pertama,
membran sel dilisis dengan penambahan detergen. Proses ini membebaskan DNA
kromosom, DNA plasmid, RNA, protein dan komponen lain. DNA kromosom dan protein
diendapkan dengan penambahan potasium. DNA + protein + potasium yang mengendap
dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA plasmid,
RNA dan protein yang tersisa dipisahkan. Kemudian ditambahkan RNase dan protese
untuk mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya DNA plasmid dapat dipresipitasi
menggunakan etanol.
2.3.4
Transfer
Plasmid
Transfer
plasmid melibatkan langkah-langkah sebagai berikut:
1.
Pilus seks yang disandi plasmid berinteraksi dengan
reseptor pada permukaan sel resipien.
2.
Terangsang oleh kontak itu, pilus menarik diri ke
dalam sel donor, dengan menarik resipien ke dalam kontak yang erat.
Terbentuklah suatu jembatan konjugasi antara kedua sel dan melalui jembatan itu
DNA ditransfer.
3.
Tergerak pula oleh proses ini adalah sintesis nuklease
yang disandi gen tra, yang membelah satu benang DNA plasmid pada suatu tempat
yang khas yang disebut asal transfer.
4.
Ujung 5’ bebas benang plasmid yang dilekukan kemudian
dijulurkan melalui jembatan konjugasi.
5.
Biasanya disalin oleh DNA polimerase sel inang, dengan
menghasilkan salinan melingkar benang ganda dalam kedua sel.
2.4 Rekombinasi DNA
Semua
organisme mengandung DNA dari bahan yang sama, yaitu gula, asam fosfat, dan
basa Nitrogen. DNA dapat disambungkan dengan DNA lain dari organisme yang
berbeda. Proses penyambungan DNA itu disebut rekombinasi DNA. Tujuanya adalah
untuk menyambungkan gen yang ada di dalam DNA. Oleh karean itu rekombinasi DNA
disebut juga rekombinasi gen.
Dalam
rekombinasi DNA dilakukan pemotongan DNA. Proses pemotongan dan penyambungan
itu menggunakan enzim pemotong dan enzim penyambung. Hasil sambungan disebut
rekombinan. Enzim pemotong disebut enzim retriksi endonuklease. Secara alami,
enzim ini dikeluarkan oleh bakteri untuk memutuskan DNA virus yang tersambung
pada DNA bakteri tanpa merusak DNA bakteri.
Alasan
dilakukanya rekombinasi adalah :
a.
Semua DNA mempunyai struktur yang sama, yakni tersusun
atas gula pentosa, asam fosfat, dan basa nitrogen.
b.
Kerena strukturnya sama, maka DNA dari sumber mana pun
dan dari spesies mana pun dapat di sambung sambungkan.
c.
Para pakar telah berhasil mengisolasi atau mensintesis
enzim.
d.
Gen dapat mengeksprasikan diri atau mengontrol
sintesis polipeptida di manapun berada.
Secara alami
rekombinasi DNA bias terjadi. Misalnya jika terjadi proses pindah silang pada
meiosis, akan terjadi tukar menukar kromatid pada kromosam yang homolog
sehingga DNA terputus dan tersambung secara silang.
2.4.1
Komponen
Yang Diperlukan Dalam Rekombinasi DNA
1.
Enzim Pemotong dan Penyambung
Enzim
pemotong dikenal sebagai retriksi atau enzim penggunting. Fungsi enzim ini
memotong motong benang DNA yang panjang menjadi pendek agar dapat disambung sambungkan
lagi. Enzim pemotong secara lami dimiliki oleh sel untuk memotong DNA di dalam
sel. Enzim pemotong itu jumlahnya banyak. Setiap enzim bekerja secara khusus.
Artinya setiap enzim hanya dapat memotong urutan basa tertentu pada DNA. Dan
hasil potonganya berupa sepenggal DNA berujung runcing yang komplemen yang di kenal
sebagai DNA ujung runcing.
Selain enzim pemotong retriksi
endonuklease, yang terdapat pula enzim penyambung yang berfungsi menyambung
DNA, yaitu enzim ligase. Enzim ligase DNA mengkatalisis ikatan fosfodiester
antar dua rantai DNA. Ligase DNA tidak dapat menyambungkan DNA untai tunggal,
melainkan harus DNA rangkap.
2.
Pembawa Gen atau Vektor
Mengingat ukuran gen yang sangat
kecil, maka memasukan gen ke dalam sel target harus menggunakan pembawa gen
atau vector. Vektor itu bertugas sebagai kendaraan bagi gen untuk mengangkut
gen masuk ke dalam sel target. Secara alami bakteri plasmid, yaitu DNA sirkuler
yang ukuranya 1/1000 komosom (DNA) bakteri, dan dapat keluar masuk sel bakteri.
Akibatnya bakteri lain tadi mendapatkan sifat baru yang berasal dari bakteri
pertama. Peristiwa ini dikenal dengan transformasi. Plasmid disambung dengan
gen terlebih dahulu sehingga terbentuk DNA hasil sambungan yang disebut sebagai
chimera (kimera) atau DNA rekombinan. Selanjutnya kimera dimasukan ke dalam sel
target yaitu sel bakteri. Sel target akan mendapatkan sifat baru sesuai denagn
gen yang diterimanya. Oleh karena itu kimera tersebut berupa DNA, maka sesuai
dengan sifatnya, kimera akan mengadakan replikasi di dalam sel inangnya
sehingga jumlahnya bertambah banyak. Dengan demikian berlangsunglah proses
pengklonan DNA. Ketika kimera melakukan repilkasi, gen yang membawanya akakn
ikut tereplikasi sehingga terjadilah pengklonan gen.
3.
Sel Target
Sel target yang hisa digunakan dalam
rekombinasi DNA adalah sel bakteri Escherichia coli. Alasanya karena :
a.
Escherichia coli mudah diperoleh dan mudah dipelihara.
b.
Tidak mengandung gen yang membahayakan (tidak ganas).
c.
Dapat membelah diri setiap 20 menit sekali sehingga
dapat diperoleh keturunan dalam jumlah besar dalam waktu singkat.
2.4.2
Proses
Rekombinasi DNA
Sel sel
bakteri yang mengandung plasmid dihancurkan kemudian diambil DNA-nya. Melalui
proses sentrifugasi, plasmid dipisahkan dari kromosom bakteri. Plasmid yang
masih berbentuk sirkuler diputus oleh enzim retriksi endonuklease pada basa
nitrogen GAATTS, sehingga terbentuklah plasmid berbentuk linier yang memiliki
ujung basa nitrogen bebas GAATTS. Plasmid ini dapat ditempeli dengan DNA asing
yang ujungnya juga memiliki basa nitrogen bebas GAATTS sehingga terbentuk
plasmid sirkuler baru dengan tambahan DNA asing. Enzim yang berperan dalam
penggabungan DNA plasmid dengan DNA asing adalah ligase. Plasmid yang
mengandung DNA asing dapat dimasukan ke dalam bakteri. Jadi, sekarang bakteri
ini mengandung DNA asing tersebut. Bakteri ini di klona sehingga bakteri turunanya
mengandung DNA asing.
Contoh
rekombinasi DNA yaitu rekombinasi gen insulin. Gen insulin pada manusia di
pulau Lngerhans di ambil, kemudian disambungkan ke dalam plasmid bakteri,
membentuk kimera (DNA rekombinan). Kimera itu dimasukan ke dalam sel target Escherichia
coli. Bakteri Escherichia coli ini di kultur untuk dikembangbiakank. Bakteri
yang biasa hidup di kolon itu ternyata mampu menghasilkan hormon insulin
manusia. Hormon insulin tersebut dipanen untuk digunakan oleh yang memerlukanya.
Sekali terbentuk bakteri rekombinan penghasil insulin manusia, selamanya akan
dapat dipanen insulin untuk pengobatan.
Tidak hanya
insulin manusia yang berhasil di produksi melalui rekombinasi DNA, melainkan
juga hormon petumbuhan manusia. Para pakar berhasil mencangkokkan gen hormon
pertumbuhan manusia ke dalam sel bakteri dan akhirnya bakteri itulah yang
memproduksi hormon pertumbuhan manusia. Hormon ini disunyikan ke orang yang
mengalami kekerdilan akibat kurangnyaproduksi hormon pertumbuhan di tubuhnya.
2.5 Kloning DNA
Kemampuan
molekul DNA membentuk rekombinan dan menjaganya dalam sel disebut kloning DNA.
Proses ini melibatkan vektor yang menjadi sarana DNA untuk memperbanyak klon
DNA dalam sel dan ‘insert DNA’ yang disisipkan di dalam vektor. Kunci untuk
menghasilkan molekul DNA rekombinan adalah enzim restriksi yang memotong DNA
pada tempat spesifik dan enzim lain yang yang menyambung DNA yang terpotong
dengan DNA lain. Dengan menghasilkan molekul DNA rekombinan yang dapat
diperbanyak pada organisme inang, fragmen DNA tertentu dapat dimurnikan dan
diamplifikasi untuk menghasilkan produk dalam jumlah besar.
2.5.1
Kloning DNA
Dalam Plasmid Vektor
DNA dipotong
dengan enzim restriksi, kemudian dimasukkan ke dalam vektor untuk diperbanyak.
Inang (host) yang umum digunakan untuk memperbanyak DNA adalah bakteri
Escherichia coli.
Vektor DNA
memiliki tiga karakteristik yaitu:
1.
Mengandung asal replikasi (origin of replication) yang
memungkinkan DNA bereplikasi secara independen/bebas dari kromosom inang.
2.
Mengandung marker selektif yang menyebabkab sel yang
membawa vector (termasuk DNA yang dibawa) dapat diidentifikasi.
3.
Memiliki situs yang unik/khas untuk satu atau lebih
enzim restriksi. Hal ini menyebabkan fragmen DNA dapat disisipkan pada tempat
tertentu dalam vector sehingga penyisipan tidak mengganggu kedua fungsi lainnya.
Proses
dimana plasmid digunakan untuk mengimpor DNA rekombinan ke sel inang untuk
kloning.
Banyak
penyakit yang disebabkan oleh perubahan gen. Pengetahuan tentang penyakit
genetik sangat meningkat melalui informasi yang diperoleh dari DNA kloning.
Dalam DNA kloning, fragmen DNA yang mengandung gen dari bunga dimasukkan ke dalam
vektor kloning atau plasmid.
Plasmid yang
membawa gen untuk resistensi antibiotik, dan sebuah rantai DNA, yang mengandung
gen yang diinginkan, keduanya adalah sama dipotong dengan restriksi
endonuklease. Plasmid adalah membuka dan gen dibebaskan dari untai DNA induk.
Mereka telah saling melengkapi "lengket berakhir." Plasmid yang
terbuka dan membebaskan gen dicampur dengan DNA ligase, yang kedua potongan
reformasi sebagai DNA rekombinan.
Plasmid dan
salinan dari fragmen DNA menghasilkan jumlah DNA rekombinan. Rebusan DNA
rekombinan ini diperkenankan untuk mengubah budaya bakteri, yang kemudian
terkena antibiotik. Semua sel kecuali mereka yang telah dikodekan oleh DNA
plasmid rekombinan tewas, meninggalkan kultur sel yang mengandung DNA
rekombinan yang diinginkan.
Kloning DNA
memungkinkan salinan setiap bagian tertentu dari DNA (atau RNA) urutan yang
akan dipilih di antara banyak orang lain dan diproduksi dalam jumlah terbatas. Teknik
ini adalah tahap pertama dari sebagian besar percobaan rekayasa genetika:
produksi perpustakaan DNA, PCR, DNA sequencing dan lainnya.
Vektor yang
paling umum berukuran kecil (kira-kira 3 kb) merupakan molekul DNA sirkular
disebut plasmid. Molekul ini biasanya ditemukan pada banyak bakteri. Pada
banyak kasus, DNA plasmid membawa gen resistensi terhadap antibiotika.
Memasukkan
fragmen DNA ke dalam vector pada dasarnya merupakan proses yang mudah. Misalnya
plasmid memiliki situs pengenalan untuk EcoRI, maka vector disiapkan dengan
memotongnya dengan Eco RI. Potongan DNA yang akan diklon kemudian disambungkan
dengan bantuan DNA ligase.
Vektor dapat
dimasukkan ke organism inang melalui transformasi.
Transformasi
merupakan proses dimana organisme inang mengambil DNA dari lingkungan. Beberapa
bakteri, tetapi bukan E. coli dapat mengambil DNA secara alami dan dikatakan
memiliki kompetensi genetik. E. coli dapat bersifat kompeten mengambil DNA
melalui perlakuan dengan ion kalsium. Antibiotika kemudian ditambahkan dalam
medium untuk menyeleksi pertumbuhan sel yang mengambil DNA plasmid - sell ini
disebut transforman. Sel yang membawa plasmid akan dapat tumbuh pada medium,
sedang yang tidak membawa plasmid, tidak dapat tumbuh.
Perpustakaan
molekul DNA (DNA library) dapat dihasilkan melalui cloning.
Perpustakaan
DNA merupakan populasi vector identik yang masing-masing berisi insert yang
berbeda. Untuk membuat perpustakaan DNA, DNA target dipotong dengan enzim
restriksi yang memberikan ukuran rata-rata insert yang diinginkan. Ukuran
insert dapat berkisar kurang dari 100 bp sampai lebih dari satu megabase. DNA
yang telah terpotong selanjutnya dicampurkan dengan vector yang sesuai (yang
dipotong dengan enzim restriksi yang sama) dan ditambah ligase. Hal ini
menghasilkan koleksi vector dengan insert DNA yang berbeda.
Berbagai
perpustakaan DNA dapat dihasilkan dengan menggunakan insert dari berbagai
sumber. Perpustakaan DNA yang paling sederhana dihasilkan dari DNA genomik
total yang disebut dengan ‘genomic libraries’.
‘cDNA
library’ dikembangkan untuk memperkaya ‘coding sequences’ dalam library. cDNA
library dibuat dengan menggunakan mRNA yang dikonversi menjadi DNA. Proses ini
disebut reverse transcription yang dilakukan oleh enzim reverse transcriptase
(Gambar 9). Saat diberi perlakuan dengan reverse transcriptase, mRNA dikonversi
menjadi kopi DNA utas ganda yang disebut cDNA (copy DNA).
Selanjutnya,
proses pembentukan library sama dengan pembentukan library pada DNA genomic.
cDNA dan vector diberi perlakuan dengan enzim restriksi yang sama dan
fragmen-fragmen hasilnya disambungkan ke dalam vector.
Hibridisasi
digunakan untuk mengidentifikasi klon spesifik dari sebuah library.
Identifikasi
fragmen dari sebuah gen di antara klon-kon dapat dilakukan dengan menggunakan
DNA probe yang urutan DNAnya sesuai dengan sebagian dari urutan DNA gen yang
diinginkan. Proses penggunaan probe dengan DNA yang dilabel digunakan untuk
melakukan screening terhadap library disebut colony hybridization.
cDNA library
akan memiliki ribuan insert yang berbeda dan masing-masing terdapat dalam vektot
umum. Setelah transformasi ke dalam bakteri khusus yang cocok sebagai inang,
sel ditumbuhkan dalam cawan petri dalam media agar. Tiap sel akan tumbuh
menjadi koloni dan tiap sel dalam koloni mengandung vector yang sama dan insert
dari library, membrane filter dengan positive charge digunakan untuk probing.
Membran ditekan di atas koloni dan cetakan koloni aakan berada pada membrane.
Selanjutnya dilakukan probing terhadap filter. Filter yang mengandung sel
diberi perlakuan yang memecah sel dan mengeluarkan DNA yang kemudian terikat
pada filter pada lokasi yang sama dengan sel. Filter selajutnya diinkubasi
dengan probe.
2.5.2
PCR (Polymerase
Chain Reaction)
PCR adalah
sebuah teknik biologi molekuler untuk mereplikasikan DNA dengan menggunakan
enzim Taq polimerase. PCR digunakan untuk mengamplifikasi bagian DNA yang
pendek (sampai 10 kb). Sejak ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1983, teknik
ini telah melahirkan teknik PCR-based marker teknik lainnya yang sangat
bervariasi.
Protokol
dasar PCR adalah:
1.
DNA utas ganda didenaturasi pada suhu 95C sehingga
membentuj DNA utas tunggal yang berfungsi sebagai cetakan.
2.
DNA utas tunggal yang pendek (disebut primer)
berikatan dengan DNA cetakan pada temperature rendah. Ikatan preimer terjadi
pada utas yang komplementer dengan cetakan pada daerah ujung batas sekuen DNA
target.
3.
Suhu ditingkatkan menjadi 72C sehingga enzim DNA
polymerase dapat melakukan sintesis DNA membentuk utas ganda DNA baru.
4.
Utas ganda DNA yang baru disintesis, didenaturasi pada
suhu tinggi dan siklus berulang.
BAB III
PENUTUP
3.1
Kesimpulan
Kriteria pewarisan sitoplasmik
Organel Sitoplasmik Pembawa Materi Genetik
Materi genetik diluar kromosom
Ø Plasmid
Ø Vektor
Ø Isolasi
DNA plasmid
Ø Transfer
Plasmid
Rekombinasi DNA
Ø Komponen
yang diperlukan dalam Rekombinasi DNA
Ø Proses
rekombinasi DNA
Kloning DNA
Ø Kloning
DNA dalam plasmid vektor
Ø PCR
(polymerase chain reaction)
DAFTAR
PUSTAKA
http://sdnegeri01cipari.blogspot.com/2010/01/pewarisan-sifat-melalui-sitoplasma.html
